多通道檢出用Real Time PCR儀-友名生物

la pcr的原理
la pcr的關(guān)鍵是具有3′→5′exonuclease活性 (proof re*g活性) 的耐熱性dna聚合酶。在pcr過程中當(dāng)有錯(cuò)誤的堿基攝入時(shí)，反應(yīng)性能將大幅度下降，takara ex taq 和takara la taq 依靠3′→5′exonuclease活性可將錯(cuò)配的堿基除去，從而延伸反應(yīng)能順利地進(jìn)行下去，使長(zhǎng)鏈dna的擴(kuò)增成為可能。
hot start pcr的原理
hot start pcr法是提高pcr特異性的重要方法之一。這種方法可以防止在pcr反應(yīng)第yi步驟因引物的錯(cuò)配或引物二聚體的形成而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增，從而可以提高目的dna部分片段的擴(kuò)增效率。takara taq hot start version，takara ex taq hot start version，takara la taq hot start version，primestar hs dna polymerase，mightyamp dna polymerase是*1體和dna聚合酶的混合制品。*1體在高溫加熱前與聚合酶相結(jié)合，*聚合酶的活性。在pcr反應(yīng)*初的dna變性步驟，多通道檢出用real time pcr儀，*1體變性，聚合酶活性恢復(fù)。
pcr循環(huán)參數(shù)
預(yù)變性模板dna完全變性與pcr酶的完全激1活對(duì)pcr能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考*說明書，一般未修飾的taq酶激1活時(shí)間為兩分鐘。
變性步驟：循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶dna序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴(kuò)增失敗。
引物退火：退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)pcr的特異性有較大影響。
引物延伸：引物延伸一般在72℃進(jìn)行（taq酶*適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定，一般推薦在1000bp以上，含pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。
循環(huán)數(shù)：大多數(shù)pcr含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。
*后延伸在*后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
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